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Activité antimicrobienne de bouillon fermenté avec des grains de kéfir 



Activité antimicrobienne de bouillon fermenté avec des grains de kéfir 

Karoline. Mme R. Silva de b, Sheila. A. Rodrigues b, Lauro Xavier Filho b, d, Álvaro. S. Lima a, c, * 

un laboratoire de génie des bioprocédés, Institut de Science et Technologie-ITP; Laboratoire b des produits naturels et de la biotechnologie, ITP; Programme c Génie des Procédés, Université Tiradentes, d Programme de santé et l'environnement; Tiradentes Université. Av.. Murilo Dantas, 300, Farolândia, 49032-490, Aracaju-SE-Brésil. 

RÉSUMÉ 

Les grains de kéfir sont originaires de la région du Caucase et sont utilisés pour préparer des boissons en utilisant une solution de sucre, le lait et jus de fruits. Tant qu'ils sont formés par la diversité des microorganismes, qui compose un consortium microbien utiles dans l'intestin, les boissons sont appelés probiotiques. Le but de cette étude était de déterminer l'activité antimicrobienne pendant la fermentation du kéfir dans un bouillon de sucre. Fermentations avec trois types d'hydrates de carbone, comme source de carbone, ont été réalisées. Le sucre brun promu les plus grands des activités antimicrobiennes, la production de halos d'inhibition correspondant à 35mm, 14mm, 12mm, 14mm, et 14mm pour le Candida albicans, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus et Escherichia coli, respectivement. Différentes concentrations de source de carbone et le temps de la fermentation influencé la taille des halos d'inhibition des micro-organismes pathogènes. 

Mots-clés: kéfir, la mélasse, de sucre Demerara, antimicrobien, la fermentation 

Introduction 

 Le kéfir est une culture naturelle mixte utilisé depuis des siècles dans les montagnes du Caucase de la Russie, qui se situent entre la mer Noire et la mer Caspienne. C'est une boisson gazeuse et d'auto-rafraîchissante légèrement qui peut être faite avec du jus de fruits, de la mélasse, le sucre, et tout type de lait, tels que la vache, de chèvre, brebis, chameaux, buffles, ou lait de soja (Santos et al, 2003.; Harta et al., 2004). La fermentation est initiée par des grains blancs ou jaunes, ressemblant à du riz cuit ou de têtes de chou-fleur petits. Les grains sont insolubles dans l'eau, gélatineuse, et avec la taille irrégulière, et ont tendance à précipiter au fond du bouillon de fermentation (Koutinas et al, 2007;.. Loretan et al, 2003). Ces grains sont composés d'une matrice d'exopolysaccharides différentes, libellés kefiran (Marquina et al, 2002;.. Rivière et al, 1967). La taille des plages de grains de kéfir entre 0,3 et 3,5 cm de diamètre, et sa composition chimique est (%, w / w): l'eau (89-90), les lipides (0,2), protéines (3,0), le sucre (6,0), et les cendres (0,7) (Garrot et al., 1997).

Le kéfir se distingue des autres boissons fermentées ceux que ce n'est pas le résultat de l'activité métabolique d'une seule espèce, mais il est fabriqué à partir de grains de kéfir, qui sont composées de divers micro-organismes. Dans les grains de kéfir il ya une association symbiotique de micro-organismes appartenant à un large spectre d'espèces et de genres, y compris les bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc et), les levures (Kluyveromyces, Candida, Saccharomyces, Pichia et), et les bactéries d'acide acétique (parfois Acetobacter) (Paraskevopoulou et al, 2003;.. Witthuhn et al, 2005). En outre, la présence de Torulaspora, Torula, et Debaryomyces dans les grains de kéfir ont déjà été signalées (Loretan et al., 2003, Simova et al., 2002).

Les microbes constituant les grains de kéfir sont capables de produire de l'acide lactique, acide acétique, l'éthanol, des peptides (bactériocines), et d'autres composants biologiquement actifs qui augmentent la capacité de stockage du lait et d'inhiber la croissance des microbes indésirables et pathogènes (Witthuhn et al. , 2005). Il ya des données qui démontrent que les lactobacilles beaucoup sont capables de produire un large éventail de composés antimicrobiens qui peuvent être utilisés dans le traitement et la prévention des infections vaginales (Farnworth, 2005). Ces grains peuvent être persévéré par la congélation, la lyophilisation et la réfrigération.

Le comportement des trois sélectionnés pathogènes d'origine alimentaire, E. coli, Listeria monocytogenes, et Yersinia enterocolitica, a été contrôlée après avoir été ajouté à kéfir fermenté et pasteurisé. La concentration en microorganismes augmenté dans une journée-fermenté kéfir, mais seulementE. coli a augmenté dans deux jours de fermentation pendant la fermentation du kéfir. Y. enterocolitica a été la souche la plus sensible qui était présente dans une journée-fermenté kéfir pendant au moins 14 jours (Gülmez et Guven, 2003). Les bactéries lactiques, également présents dans le consortium du kéfir, sont connus pour produire des composés antimicrobiens tels que les bactériocines. Ce microorganisme présente une bonne activité antimicrobienne contre les cereus Gram-positives microorganismes Bacillus, Staphylococcus aureus, et de Listeria monocytogenes, ainsi que l'microorganismes Gram négatif Pseudomonas aeruginosa, Vibrio parahaemolyticus et Aeromonas hydrophila (Pal et al., 2005). D'autres auteurs produite par le bacille bactériocines homo-fermentaire, catalase négative et microaérophiles dans la nature, avec le composé antimicrobien à large spectre montrant un inhibiteur contre dyacetilactis Lactococcus et de Bacillus cereus (Jamuna et Jeevaratnan, 2004).

Certaines études font état ​​d'une activité antimicrobienne du kéfir et suggèrent que le probiotique pourrait influer sur les troubles gastro-intestinaux de l'homme, tels que les ulcères et la diarrhée (Zubillaga et al., 2001). Apparemment, certains composés inhibiteurs de la boisson kéfir, tels que les bactériocines, peroxyde d'hydrogène, et des acides organiques pourrait être responsable de la mort des micro-organismes pathogènes. En outre, le kéfir peut également favoriser l'adhérence à la surface concurrentiel épithélium gastro-intestinal (Marquina et al., 2002). Lactobacillus isolés de kéfir ont montré une activité antimicrobienne contre les entérobactéries et vérifié que l'ingestion de kéfir spécifiquement abaissé les populations microbiennes de Enterbacteriaceae et Clostridia (Santos et al ., 2003).

Le Nord-Est du Brésil a le plus fort taux de mortalité infantile du pays (en 2005 il y avait 31,5 naissances Décès/1000 et les prévisions pour 2008 est de 26,4 naissances décès/1000) (UNICEF, 2007). La Communauté Organisation Pastoral da Criança distribue les grains de kéfir de mères ayant des enfants atteints de maladies gastro-intestinales et recommande l'ajout d'environ 1,2 g de grains de kéfir dans solution aqueuse de sucre brun (10g / L), en donnant aux enfants le bouillon fermenté 24 heures plus tard.

La région Nord-Est brésilien a une forte consommation d'alcool de l'industrie sucrière, qui utilise la canne à sucre. Produits et sous-produits de cette industrie se trouvent facilement dans le marché régional. Dans la canne à sucre à la mélasse de sucre processus peut être obtenu, qui est un épais sous-produit. Mélasse est un composé de 46,0% de sucre, 3,0% de protéines, extrait 65,0% d'azote libre, et de cendres de 8,1% (Curlian, 1983). Dans le processus de production de sucre, principalement au cours des étapes d'extraction et de raffinage, clarificateur, de tensio-actif, précipitateur, et les conservateurs sont ajoutés, qui restent après l'étape de raffinage. Le sucre brun est un produit du sucre de saccharose, avec une couleur distinctive brune due à la présence de la mélasse 3,5% (sucre brun clair) et jusqu'à 6,5% (de la mélasse sucre brun foncé). En face de sucre raffiné, sucre brun n'a pas étape de raffinage dans le traitement (Mendonça et al., 2000). Demerara sucre est un sucre intermédiaire entre le sucre raffiné et brun. Ce sucre est partiellement raffinée sucre mou constitué de sucre cristaux avec du contenu de la mélasse résiduelle ou produite par l'addition de mélasse raffinée àsucre blanc .

Le kéfir se développe mieux dans le sucre avec peu ou pas une étape de raffinage petite. Le prix du sucre brun sur le marché local est 2.98/Kg $, cependant, demerara sucre et de mélasse coûte 1,49 $ et 0.60/kg $, respectivement. L'objectif de cette étude était d'analyser l'activité antimicrobienne de grains de kéfir dans les mêmes conditions recommandées par la Communauté Organisation pastorale Criança da dans différents types et les concentrations de sucre afin de lutter contre les microorganismes pathogènes qui causent des troubles gastro-intestinaux et candidiase buccale. 

Matériels et Méthodes 

La culture Kéfir: Les grains de kéfir utilisées dans cette étude, obtenus à partir de la Communauté Organisation pastorale Criança da à Aracaju, Sergipe, Brésil ont été maintenus au Laboratoire de génie des bioprocédés de l'Institut de Science et Technologie à Aracaju, Sergipe, Brésil. Les grains de kéfir ont été cultivés à température ambiante dans une solution de sucre brun (10g / L). La solution a été stérilisée à 121 o C pendant 15 min. 

Processus de fermentation: Les grains de kéfir ont été cultivées dans des erlenmeyers de 200 ml contenant 250 ml de solutions de sucre différentes (10g / L) de cassonade, la mélasse, et demerara ainsi que dans un pH de 6,0 (ajusté à 5,0 avec HCl 0,1 M et 0,1 M NaOH) et à la température ambiante.Par la suite, les procédures de fermentation ont été répétées en utilisant la cassonade et la mélasse concentrations (2, 5, 8, 10, 12, et 15g / L). Un montant initial de 1,2 g (0,12 g dans les bases de sèches) de grains de kéfir (0,38 ± 0,10 mm) a été inoculé dans chaque flacon. 

Essais: La valeur du pH a été déterminée en utilisant un pH-mètre numérique. Biomasse a été dosée pour sa teneur en humidité d'un séchage de l'échantillon à 105 ° C jusqu'à poids constant. La réduction et la non-réductrice du sucre ont été déterminées par les méthodes Lane-Eyon. Toutes les déterminations ont été réalisées en triple exemplaire (les écarts-types étaient <0,2) (AOAC, 1998). 

L'activité antimicrobienne: Lorsque la fermentation a atteint le point de terminaison souhaité, les bouillons ont été utilisés pour déterminer l'activité antimicrobienne. Le kétoconazole (50  g / ml) et le chloramphénicol (30  g / ml) ont été utilisés comme composés antimicrobiens pour les champignons et les bactéries (contrôle), respectivement. Ils ont été choisis pour l'inclusion dans l'essai antimicrobien en fonction de leur disponibilité dans les centres d'assistance de base en santé du système de santé publique brésilien. Les micro-organismes cibles, Escherichia coli (CCT-0355),Salmonella typhi (CCT-1511), Staphylococcus Staphylococcos (ATCC-6533), Shigella sonnei (CCT-1484), et Candida albicans (ATCC 76645-) ont été cultivées dans Bushell-Hass moyen (Composition - g / L: MgSO 4 à 0,2; CaCl 2 à 0,02; KH 2 PO 4 -1,0; (NH 4) 2 HPO 4 à 1,0; KNO 3 à 1,0, et FeCl 3 - 0,05) jusqu'à ce qu'une optique similaire densité de 0,5 (échelle MacFallen). Suspensions (1 ml) de ces micro-organismes cibles ont été uniformément réparties sur les plaques (Müller-Hinton et milieu de Sabouraud pour les bactéries et les champignons, respectivement) et des puits de 6mm de diamètre ont été formés avec un tube de verre stérile au moyen d'une pompe à vide. Des échantillons de bouillon de fermentation (50  L) ont ensuite été transférés dans les puits dans les plaques de gélose, auparavant inoculés avec des micro-organismes cibles. Les plaques ont ensuite été incubées à 37 ° C. Le diamètre de halo d'inhibition a été mesurée après 24-48h (Sreeramulu et al., 2000). Toutes les déterminations ont été réalisées en triple exemplaire (les écarts-types étaient <1,5). 

Résultats et discussion 

Pendant le processus de fermentation, une augmentation progressive dans le bouillon de l'acidification de 6,91 à 2,12 a été observée pour tous les sucres utilisés dans cette enquête (Figure 01). Certains auteurs ont également vérifié une diminution de la valeur du pH après 18h de fermentation, le kéfir lyophilisées lorsque les grains ont été utilisés, même si la valeur du pH mineur avait été 4,88 (Witthuhn et al., 2005). D'autres auteurs utilisé les grains de kéfir (2,50 g / L) dans le bouillon de la canne à sucre (12%, p / v) à la production d'éthanol et a démontré que la valeur du pH changé à partir d'un pH initial de 4,95 à 4,48, après 7 jours de fermentation (Dornelles et al., 2005). La hausse de l'acidité est due à la conversion des hydrates de carbone à l'alcool (action de la levure du consortium) et à la formation d'acide organique, tel que l'acide acétique (action des bactéries du consortium).

Le sucre non-réducteur a été probablement converti enzimatically à réduire le sucre, et cette concentration en glucides augmenté jusqu'à la fin de la fermentation. Chaque substrat de sucre a été évaluée par la détermination de la biomasse produite et le sucre résiduel (en sucres réducteurs et non réducteurs) à la fin de la fermentation, et le sous-produit que l'acide acétique et l'acide lactique (vérifié par le suivi de la valeur du pH). Il a été observé que la transformation du sucre initial de ces produits et sous-produits a été 11,06%, 28,19%, et 77,04%, pour demerara sucre, la cassonade et la mélasse, respectivement. Toutefois, le rendement en biomasse eu une conversion tendance inverse de 0,58, 0,27, et 0,15, respectivement. La valeur du pH, à cette époque, était de 2,12, 2,79 et 3.28g / g pour demerara sucre, la cassonade et la mélasse, respectivement. Conversion mélange de saccharose et du glucose à l'aide de grains de kéfir étaient au-dessus de 98,7% et le rendement de la biomasse se situait entre 0,43 et 0.65g / g (Harta et al., 2004). Le sucre résiduel à la fin de la fermentation est due à des effets possibles inhibiteurs de la fermentation des sous-produits (alcools et des acides, entre autres), la présence de sucre non fermenté, l'étape du raffinage du sucre, ou d'autres éléments nutritifs la famine, parce que dans cette étude la même composition recommandée par la Communauté Organisation pastorale Criança da a été utilisé, où le milieu ne contenait que du sucre.Cette constatation corrobore les données trouvées dans la littérature (Mendonça et al., 2000). 

 

(A)

 

(B)

 

(C)

Figure 1 Résultats de la fermentation par grains de kéfir à l'aide demerara sucre (A), de sucre brun (B), et de la mélasse (C) de la concentration 10g / L.  -. De la biomasse,  pH, -Réduire le sucre, et  - sucre non réducteur. 

Le tableau 1 montre l'action de bouillon de fermentation sur les microorganismes pathogènes différents, qui ont été utilisés comme micro-organismes cibles, et ont été choisis pour promouvoir troubles gastro-intestinaux (Escherichia coli, Shigella et Salmonella sonei thyphi) comme la diarrhée. Cette desease est toujours le problème de santé le plus répandu et public important dans les pays en développement, malgré les progrès de la connaissance, la compréhension et la gestion qui ont eu lieu au cours de ces dernières années (Fagundes Neto et Scaletsky, 2000). Plusieurs fois, le problème se produit en raison de l'ingestion d'aliments contaminés par des micro-organismes infectieux ou toxigènes (Staphylococcus aureus et Shigella sonei), et est une cause majeure de morbity et une cause très importante de décès dans le monde (Alcoba-Florez et al., 2005; Bremer et al, 2004).. La levure Candida albicans est présent dans la cavité buccale humaine des enfants. L'interaction de ce micro-organisme avec des cellules muqueuses est considéré comme l'un des événements critiques initiales dans le développement de la candidose (Vieira et al, 2005;.. Bailey et al, 1995). Dans cette recherche, l'effet de la concentration du type et du sucre sur l'activité antimicrobienne, en utilisant les micro-organismes cibles cité, a été étudiée.

Il a été observé que la plus grande quantité de micro-organismes pathogènes est inhibée dans la fermentation de sucre brun après 144h. Les zones halo d'inhibition pour Candida albicans, Salmonella typhi, Shigella sonnei, Escherichia coli et Staphylococcus aureus étaient de 28, 12, 12, 12 et 14mm, respectivement, comme indiqué dans le tableau 1. Le kétoconazole promu une zone auréole d'inhibition fongique inférieurs à ceux soumis au bouillon fermenté, et le chloramphénicol a présenté un halo de la zone d'inhibition bactérienne de 16mm, avec cette valeur étant très proche de ce qui se trouve lors de l'utilisation de bouillon de fermentation (12mm). Les bactéries utilisées comme des micro-organismes cibles étaient résistants, parce coli Salmonella typhi, Shigella sonnei et Escherichia n'ont pas été inhibée par cet agent antimicrobien.

Composé intermédiaire de sucre seulement n'est pas bon pour la production de biomasse en fermentation effectué dans des conditions limitées en oxygène (pas d'agitation ou d'alimentation en air), où la fermentation d'acide lactique et d'alcool doit être favorisée par rapport à la production de biomasse. Par conséquent, le principal produit de la fermentation du saccharose, en dehors de la biomasse, l'éthanol et serait l'acide lactique. La présence de ces acides organiques dans le bouillon fermenté peut être comprise comme étant responsable de l'inhibition des agents pathogènes. Dans la fermentation avec kombucha, l'activité antimicrobienne observée était due à des acides organiques, principalement de l'acide acétique, et a été éliminée lorsque les échantillons ont été neutralisés (Greenwalt et al., 1998). Dans ce travail, le bouillon fermenté contenant du sucre demerara eu la plus faible valeur du pH, cependant, la zone auréole d'inhibition pour ce bouillon n'a pas été observé. Probablement d'un pH faible, en raison de la production d'acide organique, n'était pas la seule chose responsable de l'inhibition micro-organisme pathogène, ce qui suggère que la production des bactériocines se produit. Demerara sucre solution présente le rendement le plus élevé de la biomasse (conversion du sucre à la biomasse) et présente une zone de petit halo d'inhibition pour Candida albicans (14 mm) ou aucun des bactéries. D'autre part, la mélasse et le sucre brun (sans un processus de raffinage) présenter la plus grande zone halo de l'inhibition. 

Tableau 1. L'activité antimicrobienne des fermentées grains de kéfir de bouillon (10g / L concentration en glucides initiale) à 144h.

* Le contrôle pour le dosage des antimicrobiens; - non déterminé 

A titre illustratif, la figure 2 montre le suivi de la taille du halo de Candida albicans avec les trois sources de glucides utilisés dans ce travail pendant le processus de fermentation. Il a été observé que, après 24 h de fermentation (lorsque la valeur pH le plus élevé a été enregistré) les plus hautes valeurs de halos d'inhibition ont été vérifiées. Les données déclarées corrobore ici avec l'idée que l'activité antimicrobienne pourrait être attribuée à antimicrobienne des substances sécrétées (bactériocines) pendant la fermentation et non pas simplement à des valeurs de pH faibles. Cependant, la structure chimique du composé antimicrobien produit n'a pas été déterminée jusqu'à présent. Les bactériocines ont été produites par les lactobacilles, comme ceux présents dans les grains de kéfir, et a montré un large spectre d'inhibition contre les microorganismes cibles différentes (Jamuna et Jeevarantnam, 2004). 

Figure 2: Diamètre de halo zone pendant le processus de fermentation  - demerara sucre,  - sucre brun, et  - mélasse) pour Candida albicans. 

La concentration en sucre Brown influence expressément l'activité antimicrobienne et les meilleurs résultats ont été observés dans les concentrations minimale et maximale (2 et 15 g / L). En outre, l'activité antimicrobienne pour tous les micro-organismes pathogènes utilisés dans ce travail a été vérifiée dans la concentration 15g / L. La plus grande inhibition a été obtenue pour C. albicans (28mm). Le profil de valeurs de pH, ainsi que la concentration de la réduction et sucres non-réducteurs, la même tendance indépendamment des concentrations qui varient de 2 à 15 g / L, (figure 3).

Les grains de kéfir est entré en phase stationnaire à environ 48h de fermentation, bien que la plus grande activité antimicrobienne a été trouvé à 144h de fermentation, quand 2g / L de sucre brun (14mm - S. sonnei), 12g / L (14mm - E. coli, 16mm - S. aureus), et 15g / L (28mm - C. albicans, 12mm - S. typhi) a été utilisé, comme indiqué dans le tableau 2. Les grains de kéfir utilisées dans ce travail produit une valeur de pH 2,5, de 0,37 à 6,10 résiduelle non réductrice du sucre après 168h de fermentation. Lorsque les colonies Kombucha ont été utilisés, l'acide total après 9h était de 3,3%, et la plus forte activité antimicrobienne observée dans le processus de fermentation était en 16mm 35g / L de thé sec noir et 16mm dans 17g / L de thé noir à sec pour E. coli et Salmonella, respectivement (Greenwalt et al., 1998).

La mélasse a démontré le halo d'inhibition plus importante de micro-organismes pathogènes à 168h de fermentation. La valeur du pH, que dans des fermentations précédentes, a le profil de réduction même valeur. Cette source de glucides était plus facilement dégradé (entre 30 et 53% de sucres réducteurs a été consommé dans les 24 premières heures de fermentation). En conséquence, l'hydrolyse excellente survenu en sucres réducteurs, conduisant à leur conversion de la biomasse (Figure 3).

 

A1, A2

 

B1 B2

 

C1 C2

 

D2 D1

Figure 03: Influence de sucre brun (1) et de la mélasse (2) la concentration sur la fermentation du kéfir (Un pH-, B-biomasse, C-Réduire le sucre, et D-sucre non réducteur):  - 2g / L,  - 5g / L,  - 8 g / L,  - 10 g / L,  - 12 g / L, et  -15 g / L. 

Tableau 2: L'activité antimicrobienne des fermentées grains de kéfir de bouillon (sucre brun) à 144h.


Tableau 3: L'activité antimicrobienne des fermentées grains de kéfir de bouillon (de la mélasse) à 144h.


Une action antibiotique n'est pas efficace contre S. typhi. L'effet le plus en activité antimicrobienne a été observée à des concentrations élevées, la mélasse (14mm pour E. coli, 12mm pour S. aureus, 12mm pour S. sonnei), à l'exception de C. albicans (30 mm de 2% de glucides), comme indiqué dans le tableau 3. Lorsque 55% (p / v) de sucre commerciale est utilisé avec des colonies Kombucha, la zone halogéno inhibition de S. typhi (32mm à 21h de la fermentation) et E. coli (16mm à 14h de la fermentation) (Lima et al., 2005) a été observée. 

Conclusion

Les grains de kéfir promu l'hydrolyse de sucres non-réducteurs, qui sont convertis en acides organiques et des substances capables de produire des halos d'inhibition dans des expériences avec des microorganismes pathogènes. Le sucre brun est la source de glucides le plus efficace à action antimicrobienne, principalement contre Candida albicans (35 mm auréole zone)

 



 

 

Diamètre de halo zone (mm)

 

Sucre

Candida albicans

Salmonella typhi

Shigella sonnei

Escherichia coli

Demerara sucre

14

0

0

0

Le sucre brun

28

12

12

12

Mélasse

20

0

0

0

* Le kétoconazole

17

-

-

-

* Le chloramphénicol

-

16

0

0

Concentration initiale en sucre

Diamètre de halo zone (mm)

 

(G / L)

C. albicans

S. typhi

S. sonnei

E. coli

2

24

0

14

10

5

22

0

0

0

8

20

0

0

0

10

24

0

0

12

12

24

0

0

14

15

28

12

12

12

 

Concentration initiale en sucre

Diamètre de halo zone (mm)

 

(G / L)

C. albicans

S. typhi

S. sonnei

E. coli

2

30

0

0

0

5

30

0

0

0

8

28

0

10

0

10

24

0

12

16

12

22

0

12

14

15

20

0

0

0